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日糧中添加NCG對荷斯坦公牛氮營養(yǎng)素利用的影響（下）
更新時間：2022-07-21 關注：3572
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二、N-氨甲酰谷氨酸研究進展
1.精氨酸
精氨酸（Arginine），化學式為C6H14N4O2，分子量為174.2，是氨基酸類化合物。白色菱形結晶（從水中析出，含2分子結晶水）或單斜片狀結晶（無結晶水），無臭，味苦；易溶于水（0℃水中溶解度為83g/L，50℃水中溶解度為400g/L），微溶于乙醇，不溶于乙醚。CAS（國化學文摘服務社）編號：L-精氨酸（CAS：74-79-3），D-精氨酸（CAS：157-06-2），DL-精氨酸（CAS：7200-25-1）。
精氨酸可作為多種化合物的前體，包括一氧化氮、肌酸、尿素、多胺、脯氨酸、谷氨酸和胍基丁胺等。精氨酸參與多種代謝過程，對動物機體有多種有益作用，可促進血管生成、乳生成，促進氮代謝、生殖、泌乳、免疫和生長等過程。在廣泛的生理和病理生理條件下發(fā)揮重要作用，因此受到廣泛關注。
雖然精氨酸作為尿素循環(huán)的中間產物和肌酸生物合成的前體一直為生化學家所熟知。然而直到研究表明精氨酸是一氧化氮生物合成中氮原子的來源，人們才開始對他有了進一步研究的興趣。眾所周知，反芻動物需要從飼料中獲得必需氨基酸和非必需氨基酸，以滿足自身生長發(fā)育和維持生產。精氨酸代謝是尿素循環(huán)的重要組成部分，也是尿素合成和氨解毒的主要途徑。在氨甲酰磷酸合成酶（carbamylphosphatesynthetase-I，CPS-I）的作用下，肝細胞和腸道細胞利用氨和二氧化碳在線粒體中合成尿素。精氨酸不僅是尿素循環(huán)的中間產物，也是合成尿素、一氧化氮（NO）和多胺類物質的前體，同時還調節(jié)著對反芻動物的健康、生長和繁殖的關鍵代謝途徑。盡管反芻動物可以合成內源性精氨酸，但在生長發(fā)育的早期階段和高產時期，內源合成的精氨酸不足以滿足生長發(fā)育和維持生產水平。添加精氨酸可以通過有效調控尿素循環(huán)來降低血漿氨負荷，從而提高高產動物的生產性能和氮的利用率。
之前的研究表明，靜脈灌注精氨酸可以改善犢牛的氮代謝，提高泌乳奶牛的產奶量。多產母羊注射 精氨酸能提高羔羊出生體重，提高滿月羔羊成活率。隨著集約化程度的越來越高，為了提高經(jīng)濟效益，高產奶牛日糧中的蛋白含量往往很高，這不但增加了血氨濃度，影響奶牛繁殖性能和泌乳性能，降低氮的利用率，還增加了糞便和尿液中的氮排放，造成環(huán)境污染。因此，通過精氨酸對尿素循環(huán)的有效調控，降低血氨濃度，能夠提高高產奶牛的生產性能，提高氮的利用率。然而精氨酸的瘤胃降解率很高，無法過瘤胃到達腸道發(fā)揮生物學功能。然而通過頸靜脈灌注精氨酸的方法，雖然能夠確保精氨酸發(fā)揮生物學功能，提高反芻動物生產性能，但在現(xiàn)代牧場中難以實際應用。而飼喂瘤胃保護精氨酸也大大增加了飼養(yǎng)成本，降低了牧場在養(yǎng)殖業(yè)中的競爭力。
2.N-氨甲酰谷氨酸
NCG是N-Carbamylglutamate的簡稱，中文名稱為：N-氨甲酰谷氨酸。其分子式為C6H10N2O5，分子量是190.2，純品為無色透明晶體，CAS（國化學文摘服務社）編號為1188-38-1。NCG不溶于水，微溶于有機溶劑，活性物質等電點為3.02，其鹽類溶于水。
圖2N-乙酰谷氨酸和N-氨甲酰谷氨酸結構
N-氨甲酰谷氨酸是N-乙酰谷氨酸（N-acetylglutamate，NAG）的結構類似物，不同的是，NAG在體內易于水解，而NCG基于其理化性質，在體內外均相對穩(wěn)定，且不易被?；被崴饷附到?。眾所周知，氨基甲酰磷酸合成酶（carbamylphosphatesynthetaseI，CPS-I）是鳥氨酸循環(huán)中的限速酶，當它不活躍時，鳥氨酸的循環(huán)效率會大大降低。而NCG可以通過線粒體膜進入線粒體內部，通過促進CPS-I的活化來促進尿素循環(huán)，促進內源性精氨酸、多胺和一氧化氮的合成。一方面改善動物對氮的利用率提高生產性能，另一方面也能增加一氧化氮濃度，降低血氨濃度，提高機體抗氧化能力，促進動物機體的健康?；诓煌睦砘再|，NCG在瘤胃中降解率降低，研究表明L-精氨酸和NCG在瘤胃液中24h的降解率分別為100%和17.8%，與對照組相比，添加NCG和精氨酸的顯著提高了體外產氣量和乙酸丙酸比，降低了微生物蛋白質量。精氨酸在瘤胃的快速降解是一個營養(yǎng)浪費的過程，而NCG可以在不經(jīng)過包被處理的情況下添加到反芻動物的日糧中。
相比于精氨酸，在反芻動物生產中應用NCG還有以下好處：
?。?）NCG的價格也要低于精氨酸。
（2）相比精氨酸，NCG不會抑制日糧中的堿性氨基酸在腸道的吸收。
?。?）NCG能夠持續(xù)激活腸道瓜氨酸的合成，促進哺乳期間精氨酸的平衡。
因此，NCG是提高血漿精氨酸濃度和提高反芻動物生產性能的潛在飼料添加劑。
圖3尿素循環(huán)以及精氨酸合成的相關途徑
3.N-氨甲酰谷氨酸在動物生產中的應用
在飼料中，氮是構建蛋白質的基本單元。蛋白質是反芻動物日糧中昂貴和必需的部分。因此，在飼養(yǎng)過程中理解氮的使用對于提高養(yǎng)殖利潤、降低對環(huán)境產生的影響是特別重要的。對于反芻動物來說，小腸可利用的氨基酸是保證組織的生長和發(fā)育的重要營養(yǎng)物質。反芻動物氮營養(yǎng)素的利用基本上包括兩個方面。一方面是為瘤胃提供充足的氮和碳水化合物，保證瘤胃微生物的生長和微生物蛋白的合成，第二方面是通過小腸吸收氨基酸合成蛋白質以滿足機體的需要。
NCG作為動物機體內源精氨酸的促進劑，能夠促進機體氮代謝、生長、泌乳、繁殖和免疫等過程。提高反芻動物氮利用率意味著提高反芻動物重新利用氮的能力，這些氮主要是有毒的氨，并且來源于蛋白合成的副產物。在糞中被排放的氮是由未消化的飼料、微生物蛋白和內源性的其他來源，而在尿中被排放的氮主要來自于瘤胃內的氮損失，這種損失是由于瘤胃內大量蛋白質降解所導致的。通過降低日糧中氮濃度，或者通過微生物蛋白合成保證瘤胃內被降解氮的利用率提高，減少瘤胃氮損失，是兩種可能的方法。血液中的尿素進入瘤胃經(jīng)過兩條途徑：1）沿濃度梯度簡單擴散；2）由尿素轉運-B蛋白（Ureatransporter-B，UT-B）作為載體調節(jié)支配的擴散。進入瘤胃的尿素很快被水解為氨和二氧化碳；氨態(tài)氮可作為微生物蛋白合成的氮源，同時超過微生物利用能力的氨可被門靜脈吸收在肝臟中脫毒后循環(huán)利用。在上皮細胞中質子可以與尿素轉運蛋白形成氫鍵，導致結構發(fā)生變化，由此激活載體調節(jié)過程將尿素轉運入瘤胃。因此，內臟中尿素的合成降低了反芻動物血液中氨的含量，進而提高了氮的利用率。而尿素可以在瘤胃微生物脲酶作用下降解為氨，故氮素又可以以氨的形式被用于微生物蛋白的合成。以氨的形式進行的氮的再利用以及尿素的轉運為菌體蛋白的合成提供了氮源。一般情況下，大約有29%～99%的總肝臟排出的尿素氮在胃腸道進行重利用，在胃腸道中被利用的尿素氮約有16%～70%可以被用于同化代謝，3%～21%在糞中被損失掉，17%-80%回到尿素循環(huán)中被重新合成尿素。因此，游離尿素氮的重新利用為提高反芻動物充分利用日糧中的氮提供了氮來源。
健康的初生仔豬、犢牛、羔羊是養(yǎng)殖企業(yè)盈利的基礎。不幸的是，目前為止初生動物的死亡率仍然是世界范圍內的一個重大問題。在高緯度地區(qū)的冬季，初生動物的體溫損失嚴重，當牲畜暴露在寒冷環(huán)境中，身體儲備的營養(yǎng)物質將被分解產生熱量來保持體溫。研究表明，綿羊在妊娠中期的胎兒會產生褐色的脂肪組織儲備。內源性合成精氨酸對維持新生豬和斷奶仔豬精氨酸穩(wěn)態(tài)具有重要作用。而精氨酸還能降低母體的脂肪沉積，促進胎兒器官和組織的發(fā)育以及胎兒棕色脂肪組織的產生。
因此，在冬季妊娠期，日糧中添加NCG可能是提高動物妊娠期血漿精氨酸濃度的途徑，可維持新生兒體內環(huán)境穩(wěn)定，防止新生兒死亡，從而提高動物的生產能力和盈利能力。斷奶的仔豬、犢牛飼養(yǎng)中極易發(fā)生氧化應激，特別是腹瀉。日糧中添加NCG可以促進斷奶豬腸道生長，提高熱休克蛋白mRNA豐度，預防腸道功能障礙，改善斷奶應激，提高生長性能。此外，精氨酸的氮含量十分豐富，對幼齡哺乳動物的生長發(fā)育起著重要作用。研究表明，口服補飼NCG能夠提高小鼠血漿精氨酸和生長激素的濃度，促進小鼠的生長發(fā)育，還能提高育成豬肌肉蛋白的合成。添加NCG還能增加斷奶仔豬腸黏膜增殖細胞核抗原mRNA的表達量，誘導腸黏膜細胞生長和增殖，改善腸黏膜形態(tài)。
由此可見，斷奶期動物飼喂NCG可降低氧化應激水平，提高機體免疫力和生長性能，從而提高動物生產能力和盈利能力。
乳腺在必要時可以有效地獲取氨基酸。日糧中缺乏單一的必需氨基酸會導致在乳腺中這種氨基酸的轉運活動提高43倍，從而使得通過血液到達乳腺的這種單一的氨基酸提高33%。當從血液中去除掉某種氨基酸后，乳腺的反應會增加，這也導致其他組織對于這種氨基酸的重新利用程度降低從而提高乳腺的利用率。因此，增加乳腺可獲得營養(yǎng)物質的數(shù)量對于提高乳中氨基酸的吸收是至關重要的。N-氨甲酰谷氨酸作為精氨酸的促進劑可以調節(jié)尿素循環(huán)和可吸收氨基酸的平衡，這些氨基酸可以被乳腺用來合成乳蛋白。很多研究表明，精氨酸能夠提高奶牛的產奶量和生長激素的水平。然而高產奶牛需要飼喂高蛋白日糧以期達到高產奶量的水平，從而容易導致氨中毒，降低采食量。
現(xiàn)代的集約化飼養(yǎng)模式使得奶牛排卵期變長，無發(fā)情期，黃體期異常，激素的使用使機體內分泌紊亂，胚胎損失較大。研究表明泌乳前期奶牛血漿中的尿素氮和氨的含量都維持在較高水平，同時排卵前的卵泡液和黃體期的子宮液中的氮含量升高。這是由于飼喂高產奶牛的日糧蛋白質水平較高，血漿的尿素氮水平較高，而氨和尿素氮等含氮物質對胚胎有消極影響，降低了其繁殖能力。日糧中添加NCG可以通過促進內源精氨酸的合成提高血漿中精氨酸的濃度。研究表明添加NCG能夠顯著降低人和仔豬血漿中的氨的含量，促進尿素的再循環(huán)。與此同時，NCG還能提高血漿中一氧化氮的濃度，一氧化氮能夠清除自由基，提高機體抗氧化能力。研究表明，添加NCG能夠提高羔羊抗氧化能力和血漿中總超氧化物歧化酶的濃度。斷奶仔豬的日糧中添加NCG還能促進其小腸絨毛的發(fā)育提高生長性能，大大降低了斷奶應激帶來的腹瀉等疾病，提高經(jīng)濟效益。
因此，NCG不僅能夠增強機體免疫和抗氧化能力，還能提高動物受胎率，為大力發(fā)展健康養(yǎng)殖提供了新思路。
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三、腸道氨基酸轉運載體
腸道是動物對營養(yǎng)物質的消化吸收的主要場所。其中大部分蛋白質水解成的氨基酸會被小腸絨毛的上皮細胞所吸收。氨基酸的種類很多，參與蛋白質合成的主要有20種左右。日糧中氨基酸和肽的吸收過程就是腸道氨基酸和肽的特異性轉運載體識別運輸?shù)倪^程。氨基酸轉運載體是一種利用細胞中的三磷酸腺苷（ATP）將氨基酸從細胞外轉運到細胞內的重要蛋白質，同時還能作為信號分子作用于有關氨基酸代謝的信號通路，調控氨基酸的代謝活動，對機體的生長發(fā)育有著重要作用。根據(jù)在氨基酸的轉運過程中是否有鈉離子參與分為鈉離子依賴性氨基酸轉運載體和鈉離子非依賴性氨基酸轉運載體。其中鈉離子非依賴性氨基酸轉運載體是通過鉀離子的外流進行氨基酸的轉運。基于氨基酸不同的生理功能，氨基酸的轉運載體也分為酸性、堿性和中性氨基酸轉運載體。酸性氨基酸主要以谷氨酸和天門冬氨酸為主，SLC1A1作為特異性酸性氨基酸轉運載體，是可溶性載體家族中的1成員1；堿性氨基酸的轉運載體（SLC7A7和SLC7A9）主要負責特異性地轉運賴氨酸、精氨酸、組氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等堿性氨基酸；中性氨基酸轉運載體（SLC1A5和SLC619）主要負責的是丙氨酸、絲氨酸和半胱氨酸的轉運。作為氨基酸轉運載體的功能是多元特異性的，即能夠特異性地轉運多種氨基酸。在轉運氨基酸的時候可以將氨基酸順濃度梯度地從細胞膜外運輸?shù)郊毎麅?，也能通過鈉離子、鉀離子、氫離子和氫氧根離子的偶聯(lián)作用，將氨基酸逆濃度梯度的從細胞膜外運輸?shù)郊毎麅?。研究表明，血漿中的生長激素水平能夠提高腸道氨基酸轉運載體mRNA的表達，促進腸道對各種氨基酸的吸收。然而目前人們對氨基酸轉運載體運輸氨基酸過程的轉運機制的研究還不是很清楚。
動物對飼料中營養(yǎng)物質消化吸收的過程中，都伴隨著腸道細胞對各種營養(yǎng)素的轉運。同時在它們之間也建立相應的化學感應機制。營養(yǎng)物質會通過與細胞膜上的受體結合而造成細胞膜的電位及生理特性的改變，這種變化會被通過信號傳遞給細胞中導致多種功能性蛋白質的表達發(fā)生改變，進而調控著機體的相關信號通路。其中常見的感應機制就是氨基酸轉運載體能特異性的感受到細胞膜兩側的某種氨基酸的濃度變化，并且通過改變自身結構的方式使細胞膜的生理特性發(fā)生改變來傳遞信號。此外氨基酸轉運載體還能通過特異性感知細胞膜外氨基酸的可利用性來傳遞信號，進而影響局部氨基酸的濃度。許多研究表明，結構域蛋白、熱休克蛋白、營養(yǎng)物質轉運載體蛋白等都通過相互作用或者改變自身的結構來參與細胞中各種信號的傳遞。因此蛋白質之間的相互作用對細胞中各種信號的調控是密不可分的。
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四、動物體內蛋白合成信號通路
1.哺乳動物雷帕霉素靶蛋白的蛋白合成信號通路
哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）有2549個氨基酸構成，在mTOR的氨基端有兩個分別為親水和疏水的α螺旋組成的重復序列，這個序列能夠通過介導各種蛋白質和mTOR之間的相互作用來發(fā)揮功能，在mTOR的羧基端是功能性部分，主要由激酶組成，來抑制雷帕霉素對它的影響。mTOR蛋白合成信號通路具有調控蛋白合成的功能，它是一種參與機體信號調控的蛋白激酶，在細胞的增殖分化和動物的生長發(fā)育上發(fā)揮了重要作用。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通過mTORC1和mTORC2組成的mTOR復合物發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，mTORC1復合物受到精氨酸和亮氨酸的調控，使其聚集到溶酶體表面，激活相關蛋白的表達，促進動物所需蛋白質的合成。
2.生長因子對mTOR通路的調控
生長激素是由垂體分泌的一種肽類激素，它在mTOR的表達過程中起著調控作用。促生長因子（IGF-1）能夠作為上游信號分子通過激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）將信號傳遞給mTOR，進而激活mTOR的表達。研究表明，當肌肉的衛(wèi)星細胞受到IGF-1的刺激后，mTOR的表達水平顯著提高，促進細胞與生長相關基因的轉錄和翻譯。生長因子水平和氨基酸濃度都能激活mTOR的信號傳遞。
3.氨基酸對mTOR通路的調控
隨著國內外學者對動物營養(yǎng)的研究日益深入，關于蛋白質的研究也越來越多，然而想要充分了解蛋白質的活性、結構以及蛋白質之間的相互作用，就必須深入了解氨基酸代謝的機制與特性。氨基酸不僅能夠合成蛋白質，還能通過調控mTOR信號通路來調節(jié)機體的各項生理功能。研究表明，雷帕霉素能夠緩解經(jīng)氨基酸處理的肝細胞中自噬蛋白的降解情況。初生仔豬的日糧中添加精氨酸，能夠提高mTOR的表達，促進骨骼肌中蛋白質的合成。mTOR在細胞中發(fā)揮功能需要進行活化成磷酸化的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（Phosphorylationmammaliantargetofrapamycin，p-mTOR）。有研究發(fā)現(xiàn)，動物細胞中的胞內蛋白可以調控mTOR復合物的信號通路，提高p-mTOR的表達水平，進而促進機體蛋白質的合成。p-mTOR水平也側面反映了氨基酸對mTOR的調控程度。然而激活mTOR的上游到底是某些功能性氨基酸還是其他途徑仍然存在爭議，因此，氨基酸調控mTOR信號通路的分子機制還有待于進一步研究。
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五、本研究的目的和意義
出于對經(jīng)濟和環(huán)境的考慮，人們對降低反芻動物氮排放的同時提高生產性能產生了濃厚的興趣。在國內優(yōu)質蛋白飼料短缺的情況下，提高飼料中氮營養(yǎng)素的利用成為了突破養(yǎng)殖業(yè)瓶頸的關鍵因素。為了提高牧場在經(jīng)濟全球化背景下的市場競爭力，同時也適應我國畜牧業(yè)高速發(fā)展，集約化程度越來越高帶來的，人們對畜產品質量要求越來越高的現(xiàn)狀。因此，亟需尋找和開發(fā)一種安全、有效的飼料添加劑來提高反芻動物對氮營養(yǎng)素的利用。
本試驗通過探究日糧中添加不同劑量NCG對荷斯坦公牛生長性能、營養(yǎng)物質消化率、瘤胃發(fā)酵、氮代謝及血液生化指標的影響，確定了NCG應用于肉牛生產中的合適添加劑量；探究以尿素為氮源的日糧中添加NCG對荷斯坦公牛生長性能、營養(yǎng)物質消化率、氮排放、屠宰性能及收益的影響，揭示了NCG對飼喂尿素日糧的荷斯坦公牛對非蛋白氮利用率的影響，同時也研究了不同氮源日糧和日糧中添加NCG之間是否存在組合效應的問題；從分子水平探討以尿素為氮源的日糧中添加NCG對荷斯坦公牛腸道養(yǎng)分吸收和參與蛋白合成的信號通路中關鍵蛋白表達的影響，初步闡明了NCG對肉牛氮營養(yǎng)素利用的調控作用。旨在探究NCG對肉牛氮營養(yǎng)素利用的影響，為提高肉牛對氮營養(yǎng)素利用和減少氮排放提供技術參考，為不同氮源日糧中添加NCG在肉牛上的應用提供了理論依據(jù)。
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六、本研究的主要內容和技術路線
1、研究的主要內容
本試驗在以下三部分進行研究：
?。?）日糧中添加不同劑量的NCG對荷斯坦公牛生長性能、表觀消化率、氮代謝、瘤胃發(fā)酵和血液生化指標的影響
（2）尿素日糧中添加NCG對荷斯坦公牛生長性能、表觀消化率、氮代謝、血液生化指標、瘤胃發(fā)酵、微生物多樣性和經(jīng)濟效益的影響
?。?）尿素日糧中添加NCG對荷斯坦公牛屠宰性能、肉品質、腸道養(yǎng)分吸收和mTOR信號通路表達的影響
2、技術路線
圖4本試驗的技術路線圖
———該文章來源于作者：楊金山博士